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　　大腸菌群指那些能發(fā)酵乳糖、產(chǎn)酸產(chǎn)氣、需氧和兼性厭氧的革蘭氏陰性無芽孢桿菌。大腸菌群的存在表明系統(tǒng)已經(jīng)受到糞便污染，并可能有腸道致病菌存在，因此可能通過污染的食品引起腸道傳染病的流行。對于食品行業(yè)來講，做好大腸菌群的檢測和防御工作，至關重要。本文根據(jù)作者的經(jīng)驗，談談啤酒生產(chǎn)過程中大腸菌群的檢測及控制。

　　1. 大腸菌群與大腸桿菌的比較
　　
　　大腸菌群與大腸桿菌的定義范圍不同，其體現(xiàn)的特性也有差別，主要區(qū)別見表1所示。

　　
　　2. 大腸菌群的檢測綜述
　　
　　目前食品行業(yè)測定大腸菌群的方法有國標法（GB）、行標法（SN）和快速檢測法（3M）。三種方法各有特點，其中，國家標準采用三步法：1）乳糖發(fā)酵試驗：樣品稀釋后，選擇三個稀釋度，每個稀釋度接種三管乳糖膽鹽發(fā)酵管。36±1℃培養(yǎng)48±2h，觀察是否產(chǎn)氣。2）分離培養(yǎng)：將產(chǎn)氣發(fā)酵管培養(yǎng)物轉種于伊紅美藍瓊脂平板上，36±1℃培養(yǎng)18h—24h，觀察菌落形態(tài)。3）證實試驗：挑取平板上的可疑菌落，進行革蘭氏染色觀察。同時接種乳糖發(fā)酵管36±1℃培養(yǎng)24±2h，觀察產(chǎn)氣情況。報告：根據(jù)證實為大腸桿菌陽性的管數(shù)，查MPN表，報告每100ml（g）大腸菌群的MPN值；行標法采用兩步法：1）推測試驗：樣品稀釋后，選擇三個稀釋度，每個稀釋度接種三管LST肉湯。36±1℃培養(yǎng)48±2h，觀察是否產(chǎn)氣。2）證實試驗：將產(chǎn)氣管培養(yǎng)物接種煌綠乳糖膽鹽（BGLB）肉湯管中，36±1℃培養(yǎng)48±2h，觀察是否產(chǎn)氣。以BGLB產(chǎn)氣為陽性。查MPN表，報告每ml（g）樣品中大腸菌群的MPN值。兩種方法的比較結果見表2所示。

　　
　　因為采取的檢測方法、過程和試劑的差異，利用國標法（GB）和商檢法（SN）檢測啤酒中的大腸菌群時，得出的結論也很難絕對一致，通常商檢法（SN）的檢測結果比國標法（GB）的檢測結果稍高一些，這可能是國標法比商檢法對雜菌控制更為嚴格的緣故。另外采用3M快速檢測法檢測大腸菌群時使用的是固體培養(yǎng)基直接計數(shù)，而GB和SN的檢測都是經(jīng)過液體培養(yǎng)基增菌的。原理不一樣，結果也會有偏差，使用時應該以國標為基準進行合理校正，以增加檢測結果的可信任度和可比性。
　　
　　3. 檢測過程中的注意事項
    　
　　3.1 取樣時的注意事項
    　
　　無菌取樣時，應注意如下幾點：
　　
　　1）取樣時，要針對取樣容器的結構、材質和理化性質，選擇酒精擦拭、火焰燃燒等適當?shù)臏缇绞竭M行取樣口表面滅菌，其中在使用滅菌時，應當注意滅菌的起始位置和運動方向，防止因冷凝水沉積，而影響檢測結果。
　　
　　2）在對容器或管道進行液體無菌取樣時，要充分排除和主題基質不一致的前端樣品，排除量一般為端口體積的2—3倍為宜，以確實保證取樣的代表性，排出的樣品要用導管導入排污口或者進行回收，以減少損失，避免污染。
　　
　　3） 取樣時應盡快取樣，盡快處理，防止樣品受到二次污染或者因為環(huán)境條件的變化引起樣品中微生物的生長、繁殖和死亡，造成不應有的檢測誤差。
　　
　　4）取樣時最好使用專門的取樣器配合取樣，以避免產(chǎn)生二次污染，尤其對于那些結構復雜的取樣口容器，應盡量避免取樣口表面、內容物或者空氣對樣品造成污染，使檢測結果造成假陽性。
　　
　　5） 取樣完畢，要用清水輕輕沖洗取樣口內外表面，確保沒有積水或者酒液殘存時，用75%的酒精進行擦拭滅菌，最后用拖把將地面擦洗干凈，工具按規(guī)定放到固定的地方。
    　
　　3.2 發(fā)酵試驗時的注意事項
　　
　　檢驗的第一步是做發(fā)酵試驗，以觀察產(chǎn)酸和產(chǎn)氣現(xiàn)象。做發(fā)酵試驗時，應注意如下幾點：
　　
　　1）乳糖發(fā)酵管做法是大試管中裝一支倒立的小管，然后加入乳糖發(fā)酵液9ml—10ml，以超過小試管1cm—2cm為宜。然后滅菌，滅菌后防止小試管中產(chǎn)生氣泡，避免檢測結果出現(xiàn)假陽性。
　　
　　2） 觀察產(chǎn)氣時，主要看小導管里面是否有氣泡，有時為了把握，也可以在培養(yǎng)的次日，搖動試管仔細觀看發(fā)酵液和管壁有無小氣泡上浮，有其中之一者就可以判斷有產(chǎn)氣現(xiàn)象發(fā)生。
　　
　　3） 大腸桿菌是產(chǎn)酸產(chǎn)氣的，但是產(chǎn)氣是中間產(chǎn)物，而產(chǎn)酸是最終產(chǎn)物，所以說產(chǎn)氣不一定就有大腸桿菌，而產(chǎn)酸就可能有大腸桿菌。
　　
　　4） 為了判斷大腸菌群的存在，有時可以通過觀察產(chǎn)氣量或者基質顏色的變化幅度，來定性判斷樣品是否含有大腸菌群，對于檢測來說是一個捷徑，但實際上把握性不大，還需要進一步的分離培養(yǎng)。
　　
　　3.3 分離培養(yǎng)時的注意事項
　　
　　對于產(chǎn)酸和產(chǎn)氣的培養(yǎng)液，還要進行分離培養(yǎng)，以通過觀察菌落顏色和形態(tài)，來判斷樣品中有無大腸菌群。分離培養(yǎng)時，應注意以下幾點：
　　
　　1） 結晶紫中性紅膽鹽瓊脂，是大腸菌群固體培養(yǎng)基測定法時用到的，正常應在使用前臨時配制，放置時間最好不要超過3小時。
　　
　　2）結晶紫中性紅膽鹽瓊脂在配制時，要保證充分的煮沸和攪拌，一般應煮沸2分鐘以上，以使培養(yǎng)基成份完全溶解，直至沒有泡沫為止，最后將其溫度冷卻到45℃—50℃時使用。
　　
　　3）  按9管法測定大腸菌群時，要按實際產(chǎn)酸產(chǎn)氣的數(shù)量進行一一轉接，也就是說，如果9支發(fā)酵管全部產(chǎn)氣，那么要接種9個伊紅美蘭瓊平板。當然如果操作熟練的話，一個平板可以劃線接種兩支或更多的發(fā)酵管，但一定要標明稀釋度，作好標記，以防混淆。
　　
　　4）在用接種環(huán)從產(chǎn)氣的發(fā)酵管轉種至伊紅美蘭瓊脂（EMB瓊脂）平板過程中，劃線要均勻一致，且要注意每轉種一次，接種環(huán)要進行徹底灼燒，以免交叉污染。
    　
　　5）制取培養(yǎng)及時，要加入膽鹽、十二烷基硫酸鈉、洗衣粉、煌綠、龍膽紫、孔雀綠等抑菌劑，以抑制其它雜菌的活動，這樣有益于大腸菌群細菌的挑選，但抑菌劑同樣也會對大腸菌群中的某些菌株產(chǎn)生抑制作用。所以使用時要嚴格控制使用量，以免影響檢測結果。
　　
　　3.4 證實試驗時的注意事項
　　
　　首先觀察培養(yǎng)菌落的顏色和特征，然后挑取典型菌落進行革蘭氏染色進行證實試驗。做證實試驗時，應注意以下幾點：
　　
　　1）挑取菌落數(shù)與大腸菌群的檢出率有密切關系，只挑取一個菌落，由于機率問題，尤其當菌落不典型時，很難避免假陰性的出現(xiàn)。所以挑菌落時一定要挑取典型菌落，如無典型菌落則應多挑幾個，以增加檢查的可靠性。
    　
　　2）革蘭氏染色主要取決于細胞壁的結構，做大腸菌群的染色試驗時，應在培養(yǎng)后立即染色試驗，避免因時間過長造成假陰性。
    　
　　3）因為在酸性培養(yǎng)液中生長的細胞，蛋白質為堿性，不宜與堿性染色液染成牢固的顏色，容易出現(xiàn)假陰性，操作時要注意快速準確，把握好監(jiān)測的時間。
    　
　　4） 在做樣品的涂片時，要注意厚薄均勻，不可過厚過密，以分散開為準，否則，使酒精在規(guī)定時間內脫色不易達到一致的結果，影響對試驗結果的判斷。
    　
　　5） 在證實試驗中用到的試劑，應按照規(guī)定現(xiàn)配現(xiàn)用或配成濃溶液，臨用前稀釋，以免藥劑失效，影響檢測結果。
    　
　　4. 防止污染的措施
　　
　　大腸菌群往往通過所使用的原料、工藝過程、空氣、設備、工具等進入生產(chǎn)系統(tǒng)。為了防止污染，通常采用的措施有以下幾點：
　　
　　4.1 加強啤酒生產(chǎn)用水的環(huán)境治理和前期消毒滅菌處理，杜絕大腸菌群污染源。定期對釀造用水進行檢測，發(fā)現(xiàn)問題，立即對癥解決。
　　
　　4.2  冷麥汁設備在使用前先用85℃以上的熱水清洗滅菌，然后再用85℃1%—2%的火堿進行清潔無菌，冷卻檢測合格后投入使用。
　　
　　4.3 發(fā)酵工段的地面經(jīng)常打掃，杜絕粘滑。與生產(chǎn)無關或無用的物質及時清理出車間或定置擺放。 發(fā)酵工段的管排經(jīng)常擦抹除塵，管排連接閥門保持潔凈，連接管禁止接地。
　　
　　4.4 發(fā)酵罐使用完畢，先用清水噴淋10—15分鐘，無泡沫后，用堿性清洗劑清洗60分鐘，再用常溫水沖洗30分鐘，后用酸性清洗劑洗滌20分鐘，最后用雙氧水循環(huán)滅菌20分鐘。
　　
　　4.5 酒泵、輸酒管路和膠管除按規(guī)定鏈接有關容器執(zhí)行PIC清洗外，還要定期的做拉刷處理和甲醛浸泡處理。
　　
　　4.6 對于發(fā)酵工段的管排連接件，要經(jīng)常的進行人工刷洗或連接管路上進行管路CIP洗滌，不用時，放入特定的水槽內，用1%火堿溶液或殺菌劑（二氧化氯濃度大于200PPm，雙氧水濃度大于0.5%，常溫下浸泡，浸泡不少于2小時。使用前用無菌水沖凈或文章來源華夏酒報連接管路上進行管路CIP洗滌）。
　　
　　4.7 過濾機用完后，先用清水沖洗至無泡沫為止，用時約10—15分鐘。用40℃—50℃以上熱堿水沖洗并排放，當熱堿水變清、雜質較少時開始循環(huán)，循環(huán)10—20分鐘為止。用CIP水沖洗 ，至PH呈中性，最后用殺菌液(雙氧水≥0.5%)浸泡。過濾紙板不用時，放置在干燥通風處，防止滋生雜菌。
　　
　　4.8 灌酒機在使用前后先用冷水沖洗設備至無泡沫時，后用70℃熱水進行清洗滅菌，再用1%—2%的火堿進行清潔滅菌，完成后選擇有代表性的管酒閥進行微生物檢測，合格后方可使用。
　　
　　4.9 對生啤酒進行巴士殺菌時，殺菌PU值應控制在15—20范圍以內，以確保生啤酒中的微生物被殺滅，保證成品酒的衛(wèi)生指標合格。
　　
　　總之，做好大腸菌群的檢測工作，及時反饋啤酒生產(chǎn)過程的衛(wèi)生狀況，是改善和提高企業(yè)衛(wèi)生管理水平的重要手段。為此企業(yè)要做好以下幾方面的工作：1）要充分認識做好大腸菌群檢測工作的必要性和重要性，要投入充足的物力、財力和人力，保證硬件設施完善高效。2）科學合理的制定大腸菌群的檢測規(guī)程，嚴格按照規(guī)程和規(guī)律，做好大腸菌群的檢測工作。3）選定啤酒生產(chǎn)過程的關鍵控制點，制定出完善的控制措施，定時檢測大腸菌群水平，保證100%的衛(wèi)生合格率。4）制定科學合理的殺菌、清潔工藝和程序，完善保證措施，確保清潔殺菌過程有效地進行，做好生產(chǎn)過程的衛(wèi)生管理工作。