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    　濃香型白酒的生產(chǎn)以泥窖窖池為基礎(chǔ)，發(fā)酵過程棲息在窖池糟醅、窖泥中的龐大微生物群落在糟醅固、液、氣三相界面進(jìn)行著復(fù)雜的物質(zhì)能量代謝過程。

　　發(fā)酵過程中產(chǎn)生的黃水充當(dāng)著窖泥與糟醅物質(zhì)交換的載體，封窖發(fā)酵形成的窖內(nèi)壓力變化使酒糟中的養(yǎng)分和來自曲藥、環(huán)境中的微生物及代謝產(chǎn)物，不斷通過黃水進(jìn)入泥中，而窖泥中長(zhǎng)期馴化的微生物種群及其代謝產(chǎn)物又不斷地進(jìn)入糟醅中，物質(zhì)能量交換不斷地影響著窖泥生態(tài)環(huán)境，促文章來源華夏酒報(bào)進(jìn)了窖泥老熟和酒質(zhì)的提高。
　　然而，特定的地理、氣候等環(huán)境條件造就了特定的微生物生長(zhǎng)環(huán)境。所以，不同的酒廠生產(chǎn)的白酒呈現(xiàn)出不同的風(fēng)味和品質(zhì)。

    　因此，分析白酒窖池中微生物的群落結(jié)構(gòu)和親緣關(guān)系，對(duì)于研究中國(guó)白酒風(fēng)味因子形成機(jī)理、有效地控制生產(chǎn)環(huán)境條件和名優(yōu)白酒生產(chǎn)的品質(zhì)，有著積極的意義。

    　大分子rRNA及其基因rDNA已被作為一個(gè)分子指標(biāo)，廣泛地應(yīng)用于各種微生物的遺傳特征和分子差異的研究。把待測(cè)菌株的16SrDNA序列測(cè)定出來，然后與數(shù)據(jù)庫(kù)中的已知菌種進(jìn)行比較，即可確定供試菌株的分類地位。這種方法不僅最大程度地保證結(jié)果的準(zhǔn)確性和客觀性，而且對(duì)于微生物資源和環(huán)境的研究也有重要的價(jià)值。

    　因此，本試驗(yàn)通過對(duì)分離到的細(xì)菌進(jìn)行16SrDNA的序列分析，探討貴州地區(qū)濃香型白酒窖泥和酒醅中微生物的組成和系統(tǒng)發(fā)育情況。在本研究中，貴州地區(qū)濃香型白酒窖池中的微生物和四川境內(nèi)酒廠中的微生物類群相似，但也有區(qū)別。

1 材料與方法

    　1.1主要試劑、儀器及培養(yǎng)基

    　PCR儀為L(zhǎng)angGene MG96G；菌株DNA提取、16SrDNA片段擴(kuò)增和純化所用的各種酶、Marker、dNTPs、Buffer等試劑為上海生物工程有限公司產(chǎn)品；企業(yè)試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

    　牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基：牛肉膏3.0g，蛋白胨10.0g，氯化鈉5.0g，瓊脂20.0g，蒸餾水100ml，pH7.2—7.4，121℃滅菌20min。需要注意的是，液體牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基不加瓊脂。

    　1.2樣品的采集和菌株的分離

    　1.2.1樣品來源
    　樣品來自貴州某名酒廠盛夏生產(chǎn)用新窖窖池中的酒醅，發(fā)酵周期為60天，發(fā)酵正常。
　　新窖窖齡為2年，取樣時(shí)每個(gè)樣品分單糧上層、中層，多糧上層、中層不同部位采集；另外，還采集了窖泥壁、窖底泥和窖皮泥，所有樣品采集后抽真空冷凍保藏。

    　1.2.2菌株的分離
    　分別取樣，加入約1倍的滅過菌的PBS緩沖液，用渦旋振蕩器振蕩5min，于3000r/min離心5min，去上清液于10000r/min離心2min，棄上清液，沉淀重復(fù)洗滌2次，收集菌體備用。

　　用無菌生理鹽水對(duì)收集的菌體做10倍梯度的逐級(jí)稀釋，在牛肉膏蛋白胨平板上涂布分離，挑取形態(tài)有差異的單菌落，初步識(shí)別后，轉(zhuǎn)種于牛肉膏蛋白胨瓊脂斜面培養(yǎng)基，編號(hào)保存，進(jìn)行菌株的表型形狀觀察和實(shí)驗(yàn)。

    　1.3菌株的初步鑒定和歸類

    　按照《伯杰氏細(xì)菌堅(jiān)定手冊(cè)》（第八版）和《微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)手冊(cè)》等的鑒定方法，對(duì)所分離到的菌株進(jìn)行形態(tài)學(xué)特征的觀察和生理學(xué)特征的測(cè)試。并根據(jù)所觀測(cè)到的結(jié)果對(duì)所有菌株進(jìn)行歸類，將形態(tài)特征和生理學(xué)特征高度一致的歸為同一類群。

    　1.4基因組DNA的提取

    　參照《精編分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)指南》的方法，略作修改。取1.5ml的培養(yǎng)菌液4000r/min離心2min；沉淀物加入565uL的DE緩沖液重懸，加入30uL10%的SDS、10uL20mg/ml的蛋白酶K和10uL10mg/ml的溶菌酶，混勻，于37℃溫浴1h；再加入NaCl和CTAB/NaCl混合液，65℃溫浴10min；然后用phenol:chloroform:Isoamyl Alcohol（25:24:1）混合液和chloroform:Isoamyl Alcohol（24：1）混合液分別進(jìn)行抽提。

    　上清液加入異丙醇，混勻后于—20℃的溫度下對(duì)其沉淀30min，12000r/min離心棄上清液，最后用無水乙醇洗滌1遍，棄乙醇。向DNA沉淀中加入30uLTE緩沖液，37℃溫浴30min。

　　所得DNA溶解于TE緩沖液中，置于—20℃中保存。

    　1.5 16SrDNA和PCR擴(kuò)增及測(cè)序

    　以細(xì)菌基因組DNA為模版，采用細(xì)菌16SrDNA的通用引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。

　　PCR反應(yīng)的條件為：95℃預(yù)變性5min，95℃變性1min，55℃退火1min，72℃延伸100s，共進(jìn)行35個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸10min。
　　經(jīng)PCR反應(yīng)擴(kuò)增出16SrDNA，用PCR及酶反應(yīng)產(chǎn)物純化試劑盒將PCR產(chǎn)物來進(jìn)行純化后，再送交上海工程服務(wù)技術(shù)公司檢測(cè)。

2結(jié)果與分析

   　2.1菌株的生態(tài)特征和生理學(xué)特征

    從以上酒醅樣品中分離出203株細(xì)菌，窖泥樣品中分離出274株細(xì)菌，（其中窖泥壁87株、窖底泥92株和窖皮泥95株），初步鑒定這447株細(xì)菌中絕大多數(shù)是芽孢桿菌屬細(xì)菌（446株）。

    　2.2 16SrDNA的PCR純化結(jié)果

    　對(duì)分離菌株進(jìn)行16SrDNA的PCR純化，已分離的芽孢桿菌屬代表菌株的16SrDNA的分子大小基本上都在1400bp—1500bp之間。

    　2.3 16SrDNA序列同源性分析

    　從20個(gè)類群中各取一株代表菌株，將其16SrDNA序列在NCBI中用BLAST進(jìn)行同源性分析，結(jié)果又發(fā)現(xiàn)高度一致性的菌株。各類群代表菌株16SrDNA的同源性分析結(jié)果見表1。

    　由表1可看出，所有代表菌株的16SrDNA序列通過Blast檢索，都能在GenBank中找到同源性非常高的相近菌株的相應(yīng)序列。

　　所分析的多糧窖池樣品中細(xì)菌絕大多數(shù)為芽孢桿菌，并以芽孢桿菌屬的菌株為主，占總芽孢桿菌菌數(shù)的98.43%。

    　除芽孢桿菌屬菌株之外，還分離出極少量的Brevibacillus的不確定種菌株，占已分離總芽孢桿菌菌數(shù)的1.57%。

3討論

    　在GenBank中用BLAST進(jìn)行比較分析發(fā)現(xiàn)，從多糧窖池中分離到的芽孢桿菌與常規(guī)已知菌種都有很高的同源性。其中，將99%—100%全序列相似的判定為一個(gè)種，將97%—99%全序列相似性的判定為一個(gè)屬。根據(jù)上述標(biāo)準(zhǔn)，多糧窖池中分離到的這些芽孢桿菌大都能直接鑒定到種，只有一類菌同源性為98%，只能鑒定到屬。

    　由于微生態(tài)環(huán)境的差異和微生物長(zhǎng)期的馴化作用使得貴州地區(qū)濃香型白酒窖池中可培養(yǎng)的細(xì)菌以芽孢桿菌屬為主。

    　從本實(shí)驗(yàn)可以看出，如果僅僅運(yùn)用傳統(tǒng)的微生物菌落形態(tài)和生理生化鑒定，并不能得到非常準(zhǔn)確的結(jié)果。運(yùn)用分子生物學(xué)的方法鑒定菌株能在一定程度上彌補(bǔ)了傳統(tǒng)微生物鑒定的缺陷，使相關(guān)菌株分類鑒定更加科學(xué)和符合實(shí)際。

    　在細(xì)菌類鑒定中，用16SrDNA序列分析方法鑒定菌株也一般只能鑒定到屬或種的層面上，還需要生物技術(shù)分析方法。

    　由于窖池中生態(tài)環(huán)境復(fù)雜多變，以及微生物之間的共棲關(guān)系，窖池中還有一部分包括芽孢桿菌在內(nèi)的微生物無法分離培養(yǎng)。因此，僅僅分析可培養(yǎng)的微生物不能完全反映出窖池中的情況，對(duì)不可培養(yǎng)的芽孢桿菌的分析還需進(jìn)一步探討。另外，隨著發(fā)酵時(shí)間的推移、生態(tài)環(huán)境的改變，微生物種群結(jié)構(gòu)也會(huì)相應(yīng)地發(fā)生變化，因此，還需要對(duì)發(fā)酵過程進(jìn)行動(dòng)態(tài)跟蹤。